ISOLASI DNA

   A.    TUJUAN

Melakukan isolasi DNA dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat

B.     ALAT

1.      Tabung microcentrifuge 1,5 ml steril

2.      Micropipette

3.      Vortex

4.      Kertas absorbent

5.      Pipet otomatis

6.      Tips

7.      Zat anti coagulant (EDTA, heparin atau citrate)

8.      Sentrifuge 13.500 (13.000-16.000)

C.    BAHAN

1.      Darah (whole blood) 1 ml

2.      Cell Lysis Solution, 900 ml

3.      Nuclei Lysis Solution, 300 ml

4.      Protein Precipitation Solution, 100 ml

5.      Larutan RNA-ase 1,5 ml

6.      Isopropanol 300 ml

7.      Ethanol

8.      DNA Rehydration Solution 100 ml

D.    LANDASAN TEORI

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan.

Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sampel itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA.

Orang yang pertama melakukan penelitian mengenai rekayasa genetika adalah Paul Berg sekitar tahun 1958, dan dikenal sebagai bapak rekayasa genetika.

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

E.     CARA KERJA

·         Pengambilan Darah

1.      Menyiapkan peralatan dengan membuka kemasan spuid, alcohol swab, dan tornuiqet

2.      Mencuci tangan 7 langkah

3.      Memakai handscoon

4.      Memasang torniquet ke lengan pasien

5.      Meraba vena mediana cubiti

6.      Membersihkan daerah vena mediana cubiti secara sentripetal dengan alcohol swab

7.      Menusukkan jarum dengan arah lubang jarum menghadap keatas

8.      Mengaspirasi pelan-pelan hingga ada darah

9.      Melepas torniquet, lalu ambil darah sebanyak 1 ml

10.  Melepaskan jarum dan meletakkan alcohol swab di daerah suntikan

·         Cara kerja Isolasi DNA

1.      Mengisi tabung microcentrifuge 1,5 ml steril dengan EDTA dan memasukkan 1 ml darah ke dalamnya

2.      Menggoyangkan tabung microcentrifuge perlahan agar darah dan zat antikoagulan tercampur

3.      Mengunakan micropipette, ke dalam tabung microcentrifuge yang kedua lalu mengisikan sebanyak 900 ml Cell Lysis Solution

4.      Mempipetkan 300 µl darah dari tabung pertama lalu memasukkan kedalam tabung kedua. Membolak-balikkan tabung sebanyak 5-6 kali agar bercampur

5.      Menginkubasi tabung tersebut selama 10 menit pada temperatur ruang dan membolak-balikkan 2-3 kali

6.      Mensentrifugasi tabung microcentrifuge pada 13.500 rpm selama 20 detik pada temperatur ruang

7.      Membuang supernatant sebanyak mungkin tanpa mengganggu pellet putih yang tampak

8.      Memvortex tabung selama 10-15 detik agar endapan leukosit tersuspensi kembali

9.      Menambahkan 300 µl Nuclei Lysis Solution ke dalam suspensi. Lalu mempipetkan berulang-ulang 5-6 kali untuk melysis sel-sel darah putih. Solution akan menjadi “viscous”

10.  Menginkubasi tabung pada 37 °C hingga gumpalan terlarut. Mendinginkan tabung pada temperatur ruang

11.  Menambahkan 100 µl Protein Preciptation Solution ke larutan Nuclear Lysate dan memvortex tabung selama 10-20 detik. Sehingga gumpalan protein kecil terlihat

12.  Mensentrifugasi tabung dengan 13.500 rpm selama 3 menit dengan temperatur ruang. Pellet protein berwarna coklat tua terlihat

13.  Memindahkan supernatant ke tabung microcentrifuge bersih dan steril yang didalamnya diisi 300 µl isopropanol

14.  Membolak-balikkan tabung perlahan beberapa kali hingga larutan tercampur dan terlihat benang putih

15.  Membuang supernatant dan menambahkan 300 µl 70% ethanol ke dalam DNA. Membolak-balikkan tabung beberapa kali untuk mencuci pellet DNA, mensentrifugasi lagi tabung tersebut

16.  Mengaspirasi ethanol dengan micropipette, jangan sampai pelletnya terbuang. Lalu meletakkan tabung secara terbalik diatas kertas absorbant, mengeringkan selama 10-15 menit

17.  Menambahkan 100 µl DNA Rehydration Solution, menginkubasi pada 65°C selama 1 jam. Mencampurkan larutan dengan membiarkannya pada 4°C selama satu malam

18.  Menyimpan larutan DNA pada temperatur 2°C-8°C untuk waktu yang cukup lam

F.     KESIMPULAN

Pada percobaan yang dilakukan dengan penambahan 300 µl isopropanol ke dalam supernatant, terlihat DNA strands seperti benang-benang putih. Lalu DNA disimpan pada suhu 4°C dan didiamkan selama 1 malam.